giuliano

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IL TOMO

domenica 29 marzo 2020

IL NACHZEHRER (18)





















































Precedenti capitoli:

Il Nachzehrer (17/8)


Prosegue nel breve...:




















Epilogo (del V. A. Calmet) (19)













Ogni età, ogni nazione, ogni paese ha i suoi pregiudizi, i suoi malattie, i suoi costumi, le sue inclinazioni, che lo caratterizzano, e che passano e si susseguono; spesso ciò che ha è apparso ammirevole una volta, diventa pietoso e ridicolo in un altro secolo.

Abbiamo visto che in alcune età tutto era rivolto a un certo tipo di devozione, di studi e di esercizi. E’ noto che, per più di un secolo, il gusto prevalente dell’Europa era il viaggio a Gerusalemme. Re, principi, nobili, vescovi, ecclesiastici, monaci, tutti schiacciati in mezzo alla folla. I pellegrinaggi a Roma erano precedentemente molto frequenti e molto famosi. Abbiamo visto le province invase dai flagellanti e ora nessuno di loro rimane se non nelle confraternite dei penitenti che si sono trovate ancora in diverse parti.




Abbiamo visto in questi paesi trovatori & saltimbanchi, che in ogni momento cantarono e rimarono nelle strade, nelle piazze o nei mercati e persino nelle chiese. Le convulsioni dei nostri giorni sembra averli rianimati; i posteri ne saranno sorpresi, mentre ridiamo di loro adesso.

Verso la fine del sedicesimo e l’inizio del diciassettesimo secolo, in Lorena non si parlava altro che di maghi e streghe. Per molto tempo non ne avevamo più sentito parlare.

Quando apparve la filosofia di M. Descartes, che moda avevamo?!




L’antica Filosofia era disprezzata e non si parlava altro che di nuovi esperimenti di Fisica e Chimica, nuovi sistemi, nuove scoperte. Apparve M. Newton, tutte le menti si rivolsero a lui. Il sistema di M. Law, le banconote, la rabbia della Rue Quinquampoix; quali movimenti e rivoluzioni non causarono nel regno? Una specie di convulsione si era impadronito dei francesi.

In questa epoca, però, una nuova scena si presenta ai nostri occhi una scena presente da circa sessant’anni in Ungheria, Moravia, Slesia e Polonia.




Si vedono, si dice, uomini che sono morti da diversi mesi, ritornare sulla terra, parlano, camminano; villaggi infestati e maltrattamento di uomini e animali, succhiano il sangue dei loro vicini, per poi farli ammalare e infine causare la loro morte; così che le persone possono salvarsi solo dalle loro visite pericolose e dalle loro ossessioni esumandole, impalandole, tagliandole la testa, strappando il cuore o bruciandolo.

Questi revenans sono chiamati con il nome di voupires o vampiri, vale a dire sanguisughe; e simili casi sono correlati tra loro, così singolari, così dettagliati nei procedimenti giudiziari e informazioni conservate negli annali e non solo municipali, così ci siamo rifiutati di rimuovere tale convinzione ben documentata in quei paesi, ove, la loro presenza non solo leggenda, altresì producendo tutti quegli effetti per cui sono stati unanimemente ‘proclamati’.




L’immaginazione di coloro che credono che i morti mastichino nel loro le tombe, con un rumore simile a quello emesso dai maiali quando mangiano, è così ridicola che non merita di essere seriamente disquisita, almeno che in essa non si celino diversi e più profondi pregiudizi circa l’uomo e le razze di appartenenza.

Allora potremmo anche dire di aver visto uomini banchettare divorare nonché masticare come maiali. Io mi impegnano a trattarne la questione dei revenans o dei vampiri di Ungheria, Moravia, Slesia e Polonia, e non solo dei Paesi e Nazione dette, ma di estendere la leggenda e porla nella reale consistenza d’una più probabile Memoria. Sicuramente potremmo alla fine di tale disquisizione sostenere che questi esseri non certi umani sono veramente esistiti, oppure ancor peggio, esistono ancora, a rischio di essere criticati, ma comunque… posso discuterne.




Quelli che credono che siano vere lo faranno e mi accusano di avventatezza e presunzione, per aver sollevato un dubbio sul soggetto, o addirittura di aver negato la propria esistenza e realtà; altri mi biasimeranno per aver impiegato il mio tempo a discuterne materia che è considerata frivola e inutile da molte persone. Qualunque cosa si possa pensare, sarò contento di me stesso per aver imposto una domanda che mi è sembrata importante da punto di vista religioso nonché filosofico. Perché se il ritorno dei vampiri è reale, lo è anche la logica di dimostrarlo, e se è illusorio, lo è di conseguenza negli interessi della religione come della filosofia che per prima ha discusso di loro; quindi il non assecondare coloro che credono ad una falsa verità così da sminuire una falsa credenza o un pregiudizio insito in un errore che può essere pericoloso e produrre effetti deleteri, principio sano e non solo di vescovo ma anche del filosofo che qui mi accompagna…  




Dopo aver trattato in una tesi separata precedente alla medesima sulla questione delle apparizioni di angeli dèmoni e anime disincarnate, così come posta chiamando in causa anche il noto Imperatore Giuliano l’Apostata ed ora mio consulente sul fronte d’una nuova ed inattesa Stagione, tra breve ne ricorderemo un altro quantunque di stirpe reale il quale per le sue immonde nefandezze, immonda natura, viene citato nelle verità storiche che meglio lo ricordano e distinguono, quale vera indiscussa  origine della nota leggenda, nata da quelle stesse terre ove tali pregiudizi sembrano sorgere e non estinguersi del tutto.







Riporto breve passo:


Quella che segue è una traduzione di un racconto della fine del XV secolo delle azioni e della storia di Vlad III, che governò la Valacchia (situata nella Romania moderna) dal 1448 al 1476 in modo intermittente. le sue vittime con la posta in gioco gli valgono i nomi con cui è più noto, Vlad l'Impalatore e Dracula. Quest'ultimo era in realtà il patronimico di Vlad, ma ha guadagnato valuta come un epiteto indipendente tra gli stranieri che erroneamente pensavano che significasse "Diavolo" in rumeno.

Molti resoconti di Vlad III furono scritti negli anni successivi alla sua morte, per lo più in tedesco, e si soffermarono principalmente sulla sua propensione per la violenza gratuita e volgare. Questo antico testo russo, di cui sono state scoperte numerose copie, è l'unico racconto slavo di Dracula, ma dipinge un ritratto più sfumato, anche se più ambiguo, del principe di Valacchia. Qui, Dracula è allo stesso tempo un leader di talento, un folle omicida e un amante di enigmi e giochi di parole. Quest'ultimo attributo è il più sorprendente. Sempre preoccupato di dimostrare la sua intelligenza, il Dracula del testo russo si diverte a intrappolare le sue vittime in trappole verbali. Mentre questi capricci linguistici hanno reso il testo una sfida da tradurre, sono anche la sua migliore caratteristica, e ho mantenuto il più possibile il gioco di parole di Dracula.





Una volta, Dracula emise un annuncio in tutta la terra secondo cui chiunque fosse vecchio, o malato, in qualche modo malato o povero, tutti gli sarebbero benvenuti in proprio regno.

E una moltitudine infinita di poveri e sconosciuti si radunarono, aspettandosi da lui grande misericordia. E ordinò che fossero tutti riuniti in una grande sala, costruita a tale scopo, e ordinò che fossero dati abbastanza per mangiare e bere e, dopo aver mangiato, furono felici.

E venne da loro stesso e disse loro

“Di cosa hai bisogno di più?”

E tutti gli risposero:

“Dio e tua maestà lo sanno, mio Signore, come Dio ti istruisce”.

Quindi disse loro:

“Vorresti che ti portassi via il tuo dolore in questo mondo, in modo da non voler niente?”.

E aspettandosi da lui qualcosa di grandioso, tutti dissero:

“Facciamo, o Signore”.

E ordinò che la sala fosse chiusa e che fosse acceso un fuoco e che tutti fossero stati bruciati.

E disse ai suoi boiardi:

“Sappi che ho fatto questo: prima, in modo che i poveri non diano fastidio alle persone e che nessuno sia povero nella mia terra, ma tutto sia ricco; secondo, li ho liberati, in modo che nessuno di loro soffrisse di povertà o di malattia in questo mondo”.

(il peccatore Efrosina Il 13 febbraio dell'anno 1486 l'ho scritto per la prima volta, e poi, il 28 gennaio dell'anno 1490, l'ho copiato una seconda volta)





Ora vorrei trattare con voi in modo retto e aggiornato circa questo breve passo della Storia rimembrato, Storia vera giacché il compilatore di codesto Annale non certo un giullare o saltimbanco. E ragionando in maniera seria e composta, fuori e al di sopra della Logica del Tempo e della Memoria le quali ci impongono uno sforzo non certo recitativo come e quanto un ‘comunicato’ e/o una preghiera, semmai premettono un più profondo ragionamento che superi le condizioni del Tempo come posto.

Al di sopra della Cronaca e di un Ave Maria!

Ciò che sappiamo scorgere sia da Albe funeste della Storia detta, ma anche successivi Tramonti ove questa potrebbe risorgere non secondo i precetti del Sole così come mi suggerisce l’amico apostata, ma nell’immondo regno delle tenebre quale nuova condizione di unanime appartenenza ma non certo discendenza vanno disquisite e meditate. Albe, possiamo pensare e giustamente ragguagliare e sperare sia per i vivi quanto per tutti i morti, e non certo masticare, come tale principio in tutto il suo ‘orrore’ deduttivo in tutto l’enunciato sia stata adottato non men che applicato.

Certamente superano il frutto più o meno raccolto della leggenda medesima!





Il reverendo vescovo (Calmet) mi perdonerà se mi intrometto nel dovuto aggiornamento, ma mi sembra di scorgere una Verità se pur spesso rimembrata, certamente da molti troppi sovrani, e tutto ciò che da loro procede alla deriva della libertà e ragione, egregiamente applicata o al contrario negata, per poi subito dopo esser dimenticata in tutto l’orrore che prima e dopo ogni secolo la riguarda; contraddistinguendo l’uomo sovrano non meno dei nominati masticatori di morte, altresì non scorgendo differenza alcuna, semmai ispirazione e consuetudine scritta nel Teatro della Storia quanto dell’impalatore come del disgraziato malcapitato che ne ravviva la povera Memoria.

Come il non dover e poter dimenticare tutti i patimenti che sconvolsero l’intera crosta della Terra oltre le suddette catastrofi che ne promossero la propria o impropria ascesa e non solo di Vlad, orrori di ‘pulizie’ etniche di campi di concentramento, di fosse comuni e non solo per l’onnipresente peste, di poveri e dissidenti di credenti con viva la forza dello Spirito quanto della Ragione, fedeli ad un credo ad un mistero - un più elevato mistero -, non solo esiliati ma uccisi e torturati e poi cremati quasi vivi.





Qualcuno certamente masticava vicino a quelle tombe! E questa non certo una remota inutile leggenda! Vlad non certo il solo e il primo, la Storia dell’umanità colma di queste nefandezze.

Nefandezze che pensiamo aver superato con l’araldo e il conio dell’èvo moderno, in verità e per il vero, in maniera certamente consona ai propri tempi ogni Secolo come l’odierno nei propri caratteri genetici conserva ugual medesima ispirazione di Vlad…

…l’impalatore.

Qualcuno ci sussurra che forse l’odierno male uno scopo ha raggiunto, quasi volerci dire che anche lui non può accettarne il fine per un Dio pregato da tante troppe generazioni motivo intero di una e più Dottrine. Sì è vero apostolo e buon predicatore! Forse non regnerà più guerra né discordia, aspettando conferma della Storia se in questo Virus si nasconde un male ancor più antico, oppure al contrario in codesto ragionamento regna un falso pregiudizio, …prego con te Dio…. Solo allora potremmo certamente postulare le condizioni, e non solo del più famoso 19, evolvere sino ad estinguere quanto sin qui propriamente o impropriamente costruito.




Certamente una ed ogni cosa sarà conseguita e di nuovo edificata così come ragionata non men che applicata (così come il Cartesio o Newton citati all’inizio compresi i successivi da questi derivati non meno della leggenda), ogni Regno ed Impero ed ogni Nazione muteranno le proprie condizioni di come impostati ed applicati i criteri della semplice Democrazia. Se regna e regnerà ancora, solo allora Teologi Filosofi e Giuristi, quando la scienza avrà tradotto e sconfitto il secolare vaccino o il proprio impotente epilogo, si potrà valutare il reale e più profondo danno con il conseguente fine e sconfiggere il nuovo Virus ancora più potente e concreto del 19 ed il suo cammino.

Solo allora, dicevo, avremmo il compito più difficile da conseguire, l’invisibile lotta in nome di un più profondo credo comune ed affine alla Vita come alla Natura intera, il periglioso comune cammino giacché nulla sarà più come prima ed ogni Regno (dalla Natura e ciò che da questa deriva) tenderà a creare un proprio ‘formicaio’ così come la genesi evolutiva impone per ogni specie difendere le proprie ed altrui premesse e sopravvivenze. Il peggio dovrà ancora approdare quando indistintamente ognuno sarà censito catalogato e monitorato, si dirà per il bene Alba di un nuovo Stato (genetico-immunizzato).





Solo allora potremmo valutare seriamente fine e salvezza. Giacché nascerà una nuova èra.

Solo allora saremmo costretti a scendere nelle strade per difendere la vera Democrazia, giacché in questa breve mia, qual più profondo enunciato e vaccino, credo che ogni Stato si ricombinerà ed evolverà come Vlad l’impalatore, scrivendo conservando e eleggendo non più Dio e Natura, ma certamente ogni informatizzato laboratorio indice e disciplina per una più certa sicurezza o presunta salvezza nella falsa Gnosi scritta.

Sicuramente una discussa Economia prospererà (questo un calcolo già stabilito antico nel credo della Storia…) dopo una breve discesa, e la futura sicurezza e non solo igienica d’ognuno sarà posta qual condizione di superiore o inferiore credo ideologico scritto nella genetica quanto nella memoria artificiale informatizzata, il sogno antico di Orwelliana memoria per il bene così e finalmente raggiunto.

Solo allora potremmo scorgere il vero orrore!

Solo allora potremmo scorgere un diverso disegno!

Solo allora potremmo comprendere e valutare la vera evoluzione e leggerne di conseguenza un diverso fine se ad essa come ogni Legge di Dio non ci adeguiamo nel comune impegno di volerla salvaguardare.

Non confondendo Dio e Ragione!





Per secoli millenni se pur disquisito ha costruito anche in ciò che se pur non appare ha raggiunto il proprio superiore Fine oltre la Ragione detta, questa è sopraggiunta all’ultimo Secondo della naturale certezza forse per darci possibilità di imparare qualcosa di sì vasto e non scritto nella materia…

Se avremmo imparato evolveremo, se invece ed al contrario, ci ostiniamo, potremmo raccogliere i principi da cui scaturita la vita sia nella Simmetria quanto dall’Asimmetria in cui nata, quindi raccoglierne la cima nella barca che affonda o affonderà…

Ad una nuova ed inattesa deriva…

Solo allora potremmo comprendere il Sentiero molto più lungo e difficile nel combattere un morbo più antico prima e dopo Vlad l’impalatore…

(Vaccino)

(Prosegue...)
















mercoledì 25 marzo 2020

RaTG13 & 2019-nCoV. (15) [*]



















Precedenti capitoli:

Per ciò che non è stato detto... (13-4/1)


Prosegue con una...:





* Raccomandazione (16) &























NEL NACHZEHRER (17)













Come casi confermati di un nuovo impeto di virus in tutto il mondo con una velocità preoccupante, finora tutti gli occhi si sono concentrati su un mercato del pesce a Wuhan, in Cina, come origine dell’epidemia.

Ma una descrizione dei primi casi clinici pubblicati su The Lancet on Friday contesta tale ipotesi.

L’articolo, scritto da un folto gruppo di ricercatori cinesi di diverse istituzioni, offre dettagli sui primi 41 pazienti ricoverati in ospedale che avevano confermato infezioni con quello che è stato soprannominato ‘sequenza’ 2019 coronavirus (2019-nCoV).

Nel primo caso, il paziente si è ammalato il 1° dicembre 2019 e non ha riportato alcun collegamento con il mercato del pesce, secondo gli autori.

“Nessun legame epidemiologico è stato trovato tra il primo paziente e casi successivi”,

…affermano.




I loro dati mostrano anche che, in totale, 13 dei 41 casi non avevano alcun legame con il mercato.

“Questo è un gran numero, 13, senza alcun collegamento”,

…afferma Daniel Lucey, uno specialista in malattie infettive presso la Georgetown University.

Precedenti rapporti delle autorità sanitarie cinesi e dell’Organizzazione mondiale della sanità avevano affermato che il primo paziente aveva manifestato sintomi l’8 dicembre 2019 e che tali rapporti affermavano semplicemente che

“la maggior parte dei casi aveva collegamenti con il mercato del pesce, che è stato chiuso il 1 ° gennaio”.




Lucey afferma che se i nuovi dati sono accurati, le prime infezioni umane devono essere avvenute a novembre 2019 - se non prima - perché c’è un tempo di incubazione tra infezione e affioramento dei sintomi. In tal caso, il virus potrebbe diffondersi silenziosamente tra le persone a Wuhan - e forse altrove - prima che il gruppo di casi provenienti dall'ormai famigerato mercato all'ingrosso di frutti di mare dell'Huanan fosse scoperto alla fine di dicembre.

“Il virus è entrato in quel mercato prima che uscisse da quel mercato”,

…afferma Lucey.

I dati del documento Lancet sollevano anche domande sull’accuratezza delle informazioni iniziali fornite dalla Cina, afferma Lucey.

All’inizio dell’epidemia, la principale fonte ufficiale di informazioni pubbliche erano le comunicazioni della Commissione sanitaria municipale di Wuhan. Le comunicazioni dell’11 gennaio hanno iniziato a riferirsi ai 41 pazienti come gli unici casi confermati e il conteggio è rimasto invariato fino al 18 gennaio. Le comunicazioni non affermavano che il mercato dei frutti di mare fosse la fonte, ma hanno ripetutamente osservato che non vi erano prove di trasmissione da uomo a uomo e che la maggior parte dei casi era collegata al mercato. Poiché la Commissione Sanitaria Municipale di Wuhan ha osservato che i test diagnostici avevano confermato questi 41 casi entro il 10 gennaio e presumibilmente i funzionari conoscevano i casi clinici di ciascun paziente,

“la Cina deve aver capito che l’epidemia non ha avuto origine nel mercato del pesce di Wuhan Huanan”,




afferma Lucey a Science insider. (Lucey ha anche parlato delle sue preoccupazioni in un’intervista pubblicata ieri da Science Speaks, un progetto dell’Infectious Disease Society of America.)

Kristian Andersen, una biologa evoluzionista dello Scripps Research Institute che ha analizzato le sequenze del 2019-nCoV per cercare di chiarirne l’origine, afferma che il calendario del 1° dicembre del primo caso confermato è stato “un boccone interessante” nell’articolo di The Lancet.

“Lo scenario di qualcuno che è stato infettato al di fuori del mercato e che successivamente lo ha portato sul mercato è uno dei tre scenari che abbiamo considerato che è ancora coerente con i dati”,

…afferma.

“È del tutto plausibile dati i nostri dati e le nostre conoscenze attuali”.




Gli altri due scenari sono che l'origine era un gruppo di animali infetti o un singolo animale che è entrato in quel mercato.

Andersen ha pubblicato la sua analisi di 27 genomi disponibili di 2019-nCoV il 25 gennaio su un sito Web di ricerca virologica. Suggerisce di avere un

“antenato comune più recente, ovvero una fonte comune, già dal 1° ottobre 2019”.

Bin Cao della Capital Medical University, corrispondente autore dell’articolo di  The Lancet  e specialista polmonare, ha scritto in una e-mail a  Science Insider che lui e i suoi coautori

“apprezzano le critiche” di Lucey.




“Ora sembra chiaro che [il] mercato del pesce non è la sola origine del virus”, ha scritto.

“Ma ad essere sinceri, non sappiamo ancora da dove provenga il virus”.

Lucey osserva che la scoperta del coronavirus che causa la sindrome respiratoria del Medio Oriente, una malattia a volte fatale che si verifica sporadicamente, è arrivata da un paziente in Arabia Saudita nel giugno 2012, anche se studi successivi hanno fatto risalire a un precedente focolaio ospedaliero di polmonite inspiegabile in Giordania nell’aprile 2012. 

Quando è diventata disponibile la prima sequenza 2019-nCoV, i ricercatori l’hanno posizionata su un albero genealogico di coronavirus noti - che sono abbondanti e infettano molte specie - e hanno scoperto che era strettamente correlata ai parenti trovati nei pipistrelli.




Un team guidato da Shi Zheng-Li, uno specialista di coronavirus presso l’Istituto di Virologia di Wuhan, ha riferito il 23 gennaio su bioRxivche la sequenza 2019-nCoV era simile al 96,2% simile a un virus di pipistrello e presentava una somiglianza del 79,5% con il coronavirus che causa una sindrome respiratoria acuta grave (SARS), una malattia il cui focolaio iniziale è stato anche in Cina più di 15 anni fa. Ma il coronavirus SARS ha una relazione altrettanto stretta con i virus dei pipistrelli, e i dati di sequenza dimostrano che è saltato nelle persone da un coronavirus in zibetti che differivano dai virus SARS umani di appena 10 nucleotidi. Questo è uno dei motivi per cui molti scienziati sospettano che vi sia una specie ospite ‘intermedia’ o più tra i pipistrelli e 2019-nCoV.

Secondo l’analisi di Bedford, la sequenza di coronavirus del pipistrello evidenziata dal team di Shi Zheng-Li, soprannominato RaTG13, differisce dal 2019-nCoV da circa 1100 nucleotidi. Su nextstrain.org, un sito da lui co-fondato, Bedford ha creato alberi genealogici di coronavirus (esempio sotto) che includono sequenze di pipistrelli, zibetto, SARS e 2019-nCoV. (Gli alberi sono interattivi: trascinando il mouse del computer su di essi, è facile vedere le differenze e le somiglianze tra le sequenze.)


Le analisi di Bedford su RaTG13 e 2019-nCoV suggeriscono che i due virus condividessero un antenato comune 25-65 anni fa, una stima a cui arrivò combinando la differenza nei nucleotidi tra i virus con i tassi presunti di mutazione in altri coronavirus. Quindi probabilmente ci sono voluti decenni perché i virus simili a RaTG13 mutassero in 2019-nCoV.

La sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS), un’altra malattia umana causata da un coronavirus, ha allo stesso modo un legame con i virus dei pipistrelli. Ma gli studi hanno costruito un caso convincente che è salito agli umani dai cammelli. E l’albero filogenetico del documento bioRxiv di Shi (sotto) rende il collegamento cammello-MERS facile da vedere.



  
Più a lungo circola un virus in una popolazione umana, più tempo deve sviluppare mutazioni che differenziano i ceppi nelle persone infette, e dato che le sequenze 2019-nCoV analizzate fino ad oggi differiscono tra loro al massimo da sette nucleotidi, questo suggerisce che è saltato negli umani molto recentemente.

Ma rimane un mistero quale animale abbia diffuso il virus all’uomo.

“Esiste una vasta area grigia tra i virus rilevati nei pipistrelli e il virus ora isolato nell’uomo”,

…afferma Vincent Munster, un virologo del National Institute of Allergy and Malattie infettive degli Stati Uniti che studia i coronavirus nei pipistrelli, nei cammelli e in altre specie.

Prove evidenti suggeriscono che il mercato ha avuto un ruolo iniziale nella diffusione del 2019-nCoV, ma rimane incerto se sia stata l’origine dell’epidemia.

Molti dei casi 2019-nCoV inizialmente confermati - 27 dei primi 41 in un rapporto, 26 su 47 in un altro - erano collegati al mercato di Wuhan, ma fino al 45%, incluso il primo pugno, non lo erano. Ciò solleva la possibilità che il salto iniziale nelle persone sia avvenuto altrove.












lunedì 23 marzo 2020

CIO' CHE FORSE NON E' STATO DETTO (13)




































Precedenti capitoli:

Statistiche  di  Primavera

Prosegue negli...:

Esperimenti (per un futuro migliore?!) (14)













Volendo ricorrere all'ironia, spesso arma di sopravvivenza fondamentale nelle situazioni di panico generalizzato e antidoto alla paura di provata efficacia, potremmo dire che la Cina ha appena vissuto il suo “momento Fausto Tonna” (ex direttore finanziario durante il crac Parmalat).

Insomma, dalla denuncia di contabilità creativa nei criteri di classificazione dei nuovi contagiati da coronavirus dovuta ai criteri utilizzati per il computo all’implicita ammissione di sottostima degli stessi sono passate solo 24 ore.

E questi due grafici mettono in prospettiva la magnitudo della discrepanza occorsa in un così ridotto lasso di tempo e dopo l’annuncio di una stabilizzazione dell’epidemia, prossima ormai al picco: in un solo giorno, 14.840 nuovi casi di contagio, capaci di portare il numero totale a 48.206.

Ma se questa palese ammissione di leggerezza nel trattamento delle quarantene e nella diagnosi precoce di nuovi, potenziali contagiati apre ulteriori, enormi interrogativi rispetto alla credibilità stessa del governo cinese nella gestione dell’intera vicenda, ormai divenuta emergenza globale, nella vicenda si inserisce questo documento, datato novembre 2015 e relativo a una ricerca internazionale –  descritta in un articolo pubblicato su Nature Medicine:




L'emergere della sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus (SARS-CoV) e sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS) -CoV sottolinea la minaccia di eventi di trasmissione tra specie che portano a focolai nell'uomo.

In questo studio, esaminiamo il potenziale della malattia per i CoV simili alla SARS che circolano attualmente nelle popolazioni di pipistrelli a ferro di cavallo cinesi. Utilizzando il clone infettivo SARS-CoV, abbiamo generato e caratterizzato un virus chimerico che esprime il picco del coronavirus di pipistrello SHC014 in una spina dorsale SARS-CoV adattata al topo.

I risultati indicano che i virus del gruppo 2b che codificano il picco SHC014 in una spina dorsale di tipo selvaggio possono utilizzare in modo efficiente più ortologi del recettore ACE2, replicarsi efficacemente nelle cellule primarie delle vie aeree umane e ottenere titoli in vitro equivalenti ai ceppi epidemici di SARS-CoV. Inoltre, esperimenti in vivo dimostrano la replicazione del virus chimerico nel polmone del topo con notevole patogenesi.

La valutazione delle modalità immunoterapiche e profilattiche basate sulla SARS ha rivelato scarsa efficacia; entrambi gli approcci con anticorpi monoclonali e vaccini non sono riusciti a neutralizzare e proteggere dai CoV utilizzando la nuova proteina spike. È importante sottolineare che, sulla base di questi risultati, abbiamo ridistribuito sinteticamente un virus ricombinante SHC014 a lunghezza intera infettiva e dimostrato una solida replicazione virale sia in vitro che in vivo. Insieme, il lavoro evidenzia un continuo rischio di riemergenza SARS-CoV da virus attualmente circolanti nelle popolazioni di pipistrelli.



  
La comparsa della sindrome respiratoria acuta grave Il coronavirus (SARS-CoV) ha inaugurato una nuova era nella trasmissione tra le specie di gravi malattie respiratorie. Da allora, numerosi ceppi, tra cui l'influenza A H5N1, H1N1, H7N9 e Sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS) CoV, sono emersi da popolazioni di animali che hanno causato malattie e mortalità considerevoli. Mentre le misure di salute pubblica hanno messo a tacere l'epidemia di SARS-CoV, recenti studi di metagenomica hanno identificato sequenze di virus simili a SARS strettamente correlati che circolano nelle popolazioni di pipistrelli cinesi che potrebbero rappresentare una minaccia futura.

Tuttavia, i soli dati di sequenza forniscono informazioni minime per identificare e preparare futuri virus pre-pandemici. Pertanto, per esaminare il potenziale di emergenza dei CoV circolanti, abbiamo creato un virus chimerico che codifica una nuova proteina spike zoonotica nel contesto di una spina dorsale di CoV praticabile. Questo approccio ha caratterizzato la minaccia rappresentata dal picco di SHC014-CoV nelle cellule primarie delle vie aeree umane, in vivo, nonché l'inefficacia delle terapie immunitarie disponibili. Insieme, la strategia traduce i dati metagenomici per aiutare a prevedere e prepararsi per i futuri virus emergenti.



Le sequenze SHC014 e WIV1 rappresentano i parenti più vicini ai ceppi epidemici SARS-CoV (Fig. 1 a, b), ma mantengono importanti differenze nei 14 residui che legano l'ACE2 umano, inclusi i cinque critici per l'intervallo ospite: Y442, L472, N479, T487 e Y491 6 . Nel WIV1, tre di questi residui differiscono dalla SARS-CoV Urbani, ma non ci si aspettava che alterassero il legame (Figura 1a, b supplementare, Tabella 1 supplementare). Questo fatto è confermato da entrambi gli esperimenti di pseudotipizzazione (Figura 1d supplementare) e dalla replicazione in vitro di WIV1-CoV 5. Al contrario, sette dei 14 residui di interazione ACE2 in SHC014 sono diversi da SARS-CoV, inclusi tutti e cinque i residui critici (Supplementary Fig. 1c, Supplementary Table 1). Questi cambiamenti, associati al fallimento dello pseudotipo (Fig. 1d supplementare), hanno suggerito che il picco SHC014 non è in grado di legare l'ACE2 umano. Tuttavia, cambiamenti simili erano stati segnalati per trasmettere il legame ACE2 nei ceppi SARS-CoV correlati 6, 7 e quindi suggerito che per la verifica erano necessari test funzionali. Pertanto, abbiamo sintetizzato il picco SHC014 nel contesto del backbone SARS-CoV adattato al mouse competente per la replica (SHC014-MA15) (Figura 2a supplementare). Nonostante le previsioni di entrambi i modelli basati sulla struttura e gli esperimenti di pseudotipo, SHC014-MA15 era praticabile e replicato a titoli elevati nelle cellule Vero (Figura 2b supplementare). Simile alla SARS, SHC014-MA15 richiedeva anche una molecola ACE2 funzionale per l'ingresso, ma utilizza ortologi umani, zibetto e pipistrello (Figura 2c, d supplementare).




Per testare la capacità del picco SHC014 di mediare l'infezione delle vie aeree umane, abbiamo esaminato le cellule Calu-3 2B4, una linea cellulare epiteliale umana, e abbiamo trovato una solida replica SHC014-MA15 paragonabile alla SARS-CoV Urbani (Fig. 1c). Per estendere questi risultati, le colture epiteliali delle vie aeree umane primarie (HAE) sono state infettate e hanno indicato una replicazione robusta di entrambi i virus (Fig. 1d). Insieme, i dati confermano la capacità del picco SHC014 di infettare le cellule delle vie aeree umane e sottolineano la minaccia della trasmissione tra specie.

I virus simili alla SARS si replicano nelle cellule delle vie aeree umane e producono patogenesi in vivo (a) Le sequenze del genoma a lunghezza intera di CoV rappresentative sono state allineate e mappate filogeneticamente come descritto nei metodi. La barra di scala rappresenta sostituzioni nucleotidiche, con solo il supporto bootstrap superiore al 70% etichettato. L'albero mostra i CoV divisi in tre gruppi filogenetici distinti, definiti come α , β e γ . I cluster di sottogruppi classici sono contrassegnati come 2a – 2d per i CoV β e 1a e 1b per i CoV α . ( b ) I domini S1 delle sequenze di aminoacidi di picco di CoV β rappresentativi del gruppo 2b, incluso SARSCoV, erano allineati e mappati filogeneticamente. La barra della scala rappresenta le sostituzioni di aminoacidi. (c- d) Replicazione virale di SARS-CoV Urbani (nero) e SHC014-MA15 (verde) a seguito di infezione di (c) cellule Calu-3 2B4 o (d) colture cellulari epiteliali delle vie aeree umane ben differenziate, aria-liquido primarie un MOI di 0,01. I campioni sono stati raccolti in singoli punti temporali con repliche biologiche ( n = 3) sia per gli esperimenti Calu3 che per gli HAE. ( E - h ) in vivo infezione di 10 settimane di età BALB / topi c infettati con 1 × 10 4 PFU di topo adattato SARS-CoV MA15 (nero) o SHC014-MA15 (verde) tramite l' in rotta che mostra ( e ) perdita di peso ( n = 9 per MA15 n= 16 per SHC014-MA15) e ( f ) replicazione virale nel polmone ( n = 3 per MA15, n = 4 per SHC014-MA15) e antigene rappresentativo anti-SARS-CoV N che tende per (g) SARS-CoV MA15 e (h) SHC014-MA15. Per ogni figura grafica, valore centrale rappresentativo della media di gruppo e barre di errore definite da SEM.




Successivamente abbiamo valutato l'infezione in vivo di topi BALB / c di 10 settimane con 10 4 unità formanti placca (PFU) di SARS-MA15 o SHC014-MA15 (Fig. 1e-h). Gli animali infetti da SARS-MA15 hanno subito una rapida perdita di peso e letalità per quattro giorni dopo l'infezione (DPI); al contrario, SHC014-MA15 ha prodotto una sostanziale perdita di peso (10%), ma nessuna letalità (Fig. 1e). L'esame della replicazione virale ha rivelato titoli quasi equivalenti da polmoni di topi infetti da SARS-MA15 e SHC014-MA15 (Fig. 1f). Mentre SARS-CoV MA15 ha prodotto una colorazione robusta sia nei bronchioli terminali che nel parenchima polmonare 2 DPI (Fig. 1g), SHC014-MA15 presentava un deficit nella colorazione dell'antigene delle vie aeree (Fig. 1h).

Al contrario, nessun deficit equivalente è stato osservato nel parenchima o nel punteggio istologico complessivo, suggerendo un'infezione differenziale dopo SHC014-MA15 (Tabella supplementare 2). Passando agli animali anziani più sensibili, gli animali infetti SARS-MA15 hanno perso rapidamente peso e soccombono alle infezioni (Figura 3 a, b supplementare); SHC014-MA15 indusse una perdita di peso robusta e sostenuta, ma ebbe una mortalità minima.

L'istologia e le tendenze di colorazione dell'antigene osservate nei topi giovani sono state conservate negli animali più anziani (Tabella Supplementare 3). Abbiamo escluso l'uso di un recettore alterativo basato sull'infezione da topi Ace2 - / - , che non ha prodotto perdita di peso o colorazione dell'antigene a seguito dell'infezione SHC014-MA15 ( Figura complementare 4a, b; Tabella supplementare 2 ). Insieme, i dati indicano che i virus che utilizzano il picco SHC014 sono in grado di indurre una considerevole malattia nei topi nel contesto di una spina dorsale virale CoV.




Data l'efficacia delle terapie con anticorpi monoclonali di Ebola come ZMApp, abbiamo successivamente cercato di determinare l'efficacia degli anticorpi monoclonali SARS-CoV contro SHC014-MA15. Quattro ampiamente neutralizzando gli anticorpi monoclonali umani erano stati precedentemente segnalati e sono probabili reagenti per l'immunoterapia.

Esaminando l'inibizione percentuale, SARS-CoV Urbani di tipo selvaggio è stato fortemente neutralizzato da tutti e quattro gli anticorpi a concentrazioni di anticorpi relativamente basse (Fig. 2a-d). Al contrario, la neutralizzazione variava per SHC014-MA15. Fm6, un anticorpo generato dall'esposizione dei fagi e dai mutanti di fuga 10, 11, ha raggiunto solo livelli di inibizione di SHC014-MA15 di fondo (Fig. 2a). Allo stesso modo, anche gli anticorpi 230.15 e 227.14, derivati ​​dalle cellule della memoria B dei pazienti con infezione da SARS-CoV 12 , non sono riusciti a bloccare SHC014-MA15 ( Fig. 2b, c ). Per tutti e tre gli anticorpi, le differenze tra i picchi SARS e SHC014 corrispondevano a cambiamenti di residui diretti o adiacenti rilevati nei mutanti di fuga (fm6 - N479R; 230.15 - L443V; 227.14- K390). Infine, l'anticorpo monoclonale 109,8 è stato in grado di ottenere una neutralizzazione del 50% di SHC014-MA15, ma solo a concentrazioni molto elevate ( Fig. 2d ). Insieme, i risultati dimostrano che, nonostante lo sviluppo di anticorpi ampiamente neutralizzanti contro SARS-CoV, questi reagenti possono avere solo un'efficacia marginale contro ceppi emergenti di CoV simili a SARS come SHC014.




Gli anticorpi monoclonali SARS-CoV hanno un'efficacia marginale nei confronti di CoV simili a SARS L'efficacia della neutralizzazione è stata valutata utilizzando saggi di neutralizzazione percentuale contro SAR-CoV Urbani (nero) o SHC014-MA15 con un pannello di anticorpi monoclonali: ( a ) fm6 ( n = 3 per Urbani, n = 5 per SHC014-MA15) 10 , 11 , ( b ) 230.15 ( n = 3 per Urbani, n = 2 per SHC014-MA15), ( c ) 227.15 ( n = 3 per Urbani, n = 5 per SHC014-MA15) e ( d ) 109.8 ( n = 3 per Urbani , n = 2 per SHC014-MA15) 12, sono stati originariamente generati contro l'epidemia di SARS-CoV. Ciascun punto dati rappresentativo di più valori centrali rappresenta la media di gruppo e le barre di errore definite da SEM.

Per valutare i vaccini esistenti contro SHC014-MA15, i topi anziani sono stati vaccinati con SARS-CoV intero intero (DIV) a doppia inattivazione. In precedenza, il DIV aveva mostrato neutralizzazione e protezione dalla sfida del virus omologa, ma l'insufficienza del vaccino e la patologia immunitaria aumentata negli animali anziani indicavano una possibilità di danno a causa della vaccinazione. In questo studio, DIV non ha fornito protezione da SHC014-MA15 per quanto riguarda la perdita di peso o il titolo virale (Figura 5a, b supplementare). In linea con i precedenti rapporti 14, anche il siero di topi anziani vaccinati con DIV non è riuscito a neutralizzare SHC014-MA15 (Figura 5c supplementare). Forse ancora più importante, la vaccinazione con DIV ha prodotto una solida patologia immunitaria (Tabella supplementare 4) ed eosinofilia ( Figura 5d – f supplementare ). Insieme, questi risultati confermano l'insufficienza del vaccino DIV e la malattia aumentata illustrata per il gruppo vaccinato invecchiato.




Contrariamente a DIV, la sfida SHC014-MA15 come vaccino ha mostrato risultati promettenti, ma con avvertimenti importanti. Utilizzando una dose elevata, abbiamo infettato i topi giovani con SHC014-MA15 e seguito per 28 giorni; i topi sono stati successivamente sfidati con SARS-MA15 (Figura 6a supplementare). Una precedente infezione da alte dosi con SHC014-MA15 conferiva protezione contro la sfida letale SARS-MA15, ma solo una minima risposta di neutralizzazione SARS-CoV dagli antisieri SHC014-MA15 (Figura 6b supplementare, 1/200) implicava una protezione ridotta nel tempo. Risultati simili sono stati osservati nei topi BALB / C anziani in termini di perdita di peso e replicazione virale (Figura 6c, d supplementare). Tuttavia, questa dose di infezione ha indotto > 10% di perdita di peso e letalità in alcuni animali anziani (Fig. 1 e Figura 3 supplementare). Usando l'infezione a basso dosaggio, SHC014-MA15 non è riuscito a proteggere gli animali anziani dalla sfida letale SARS-CoV (Figura 6e, f supplementare). Insieme, i dati suggeriscono che la sfida SHC014-MA15 può conferire protezione incrociata contro SARS-CoV attraverso epitopi conservati, ma richiede una dose che induca la patogenesi.

Avendo stabilito il picco SHC014 come una potenziale minaccia, abbiamo successivamente sintetizzato un clone infettivo SHC014-CoV a lunghezza intera basato sull'approccio utilizzato per SARS-CoV ( Fig. 3a ) 15 . La replica nelle cellule Vero non ha rivelato deficit per SHC014-CoV rispetto a SARS-CoV (Fig. 3b); tuttavia, SHC014-CoV è stato significativamente attenuato (p <0,01) nelle colture epiteliali primarie delle vie aeree umane sia a 24 che a 48 ore dopo l'infezione (Fig. 3c). L'infezione in vivo non ha dimostrato una significativa perdita di peso, ma ha definito una replicazione virale ridotta per l'infezione da SHC014-CoV a lunghezza intera rispetto alla SARS-CoV Urbani (Fig. 3d, e). Insieme, i risultati stabiliscono la vitalità di SHC014-CoV a tutta lunghezza, ma suggeriscono che è necessario un ulteriore adattamento equivalente alla replicazione di SARS-CoV epidemica nelle cellule respiratorie umane e nei topi.




SHC014-CoV a tutta lunghezza si replica nelle vie aeree umane, ma manca di virulenza da SARS epidemica ( a ) Il clone molecolare SHC014-CoV è stato sintetizzato come sei cDNA contigui designati A - F affiancati da siti BglI unici che consentivano l'assemblaggio diretto di cDNA a lunghezza intera. (b - c ) Replicazione virale di SARS-CoV Urbani (nero) e SHC014-CoV (verde) a seguito di infezione di ( b ) cellule Vero o ( c ) colture cellulari epiteliali delle vie aeree umane ben differenziate, aria liquida primaria e interfaccia di un MOI di 0.01. I campioni sono stati raccolti in un singolo momento con replicati biologici (n = 3) per ciascun gruppo e rappresentativi di 1 esperimento sia per Vero che per HAE. (d - e) In vivoinfezione di topi BALB / c di 10 settimane infettati con 1 × 10 5 PFU di SARS-CoV Urbani (nero), SARS-CoV MA15 (grigio) o SHC014-CoV (verde) tramite la via di arrivo che mostra ( d ) perdita di peso ( n = 3 per MA15, n = 7 per SHC014-CoV, n = 6 per SARS-Urbani) e ( e ) replicazione virale ( n = 3 per SARS-Urbani e SHC014-CoV) nel polmone. Ciascun punto dati rappresentativo di più valori centrali rappresenta la media di gruppo e le barre di errore definite da SEM. I valori P basati sul test T di Student a 2 code di singoli punti temporali e sono contrassegnati come indicato: ** <0,01 *** <0,001.

Durante l'epidemia di SARS-CoV, furono rapidamente stabiliti collegamenti tra zibetti di palma e ceppi di coronavirus rilevati nell'uomo. Basandosi su questa scoperta, il paradigma dell'emergenza comune ha sostenuto che l'epidemia di SARS-CoV è nata come virus di pipistrello, è passata agli zibetti e ha incorporato i cambiamenti all'interno del RBD per migliorare il legame con lo zibetto Ace2 16. La successiva esposizione all'uomo nei mercati vivi ha permesso l'infezione con il ceppo di zibetto, che, a sua volta, si è adattato per diventare il ceppo epidemico (Fig. 4a). Tuttavia, l'analisi filogenetica ha suggerito che i primi ceppi SARS umani sembrano più strettamente correlati al pipistrello rispetto ai ceppi di zibetto 16. Pertanto, un secondo paradigma ha sostenuto che la trasmissione diretta pipistrello-umano ha avviato l'emergenza SARS-CoV, con zibetti di palma che fungono da ospite secondario e serbatoio per l'infezione continua ( Fig. 4b , 17 ). Per entrambi i paradigmi, l'adattamento del picco in un ospite secondario è visto come una necessità, con la maggior parte delle mutazioni attese all'interno dell'RBD e facilitando il miglioramento dell'infezione. Entrambe le teorie implicano che i pool di CoV di pipistrelli sono limitati e che le mutazioni del raggio ospite sono sia casuali che rare, riducendo la probabilità di eventi di emergenza futuri nell'uomo.




I ceppi di coronavirus sono mantenuti in pool di quasi specie circolanti nelle popolazioni di pipistrelli. (a - b) Le teorie sull'emergenza della SARS-CoV tradizionale affermano che i mutanti della gamma degli ospiti (cerchio riempito di rosso) rappresentano eventi casuali e rari che consentono l'infezione di ospiti alternativi. (a) Il paradigma dell'ospite secondario sostiene che un ospite non umano è infetto da un virus progenitore del pipistrello e, attraverso l'adattamento, facilita la trasmissione all'uomo; la successiva replicazione nell'uomo porta al virus dell'epidemia. (b) Il paradigma diretto suggerisce che la trasmissione avviene tra pipistrelli e umani senza che sia richiesto un ospite intermedio; la selezione si verifica quindi nella popolazione umana con virus strettamente correlati che si replicano in un ospite secondario, consentendo la persistenza e l'adattamento virali continui in entrambi. (c) I dati provenienti da virus chimerici simili alla SARS sostengono che i pool di quasi specie mantengono più virus in grado di infettare le cellule umane senza la necessità di mutazioni (cerchi riempiti di rosso). Mentre adattamenti in ospiti secondari o umani possono essere richiesti per l'emergenza epidemica, se combinati con backbone virulenti di CoV (contorni verdi), la malattia epidemica può essere il risultato nell'uomo. I dati esistenti supportano elementi di tutti e tre i paradigmi.

Pur non invalidando le altre vie di emergenza, il presente studio sostiene un terzo paradigma in cui i pool di CoV di pipistrelli circolanti mantengono proteine ​​di picchi "in bilico" in grado di infettare l'uomo senza mutazione o adattamento (Fig. 4c). Illustrato con picco SHC014 nella spina dorsale SARS-CoV, si verifica un'infezione robusta in entrambe le culture delle vie aeree umane e in vivo senza adattamento RBD. Associato alla precedente identificazione di backbone CoV patogeni, i risultati suggeriscono che i materiali di partenza richiesti per i ceppi emergenti simili alla SARS circolano attualmente in serbatoi di animali. È importante sottolineare che, sebbene SHC014-CoV a tutta lunghezza richieda probabilmente un ulteriore adattamento della spina dorsale per mediare la malattia umana, gli eventi di ricombinazione ad alta frequenza documentati nelle famiglie di CoV sottolineano la possibilità di emergenze future e la necessità di ulteriore preparazione.




Ad oggi, gli schermi di genomica delle popolazioni animali sono stati utilizzati principalmente per identificare nuovi virus nelle impostazioni delle epidemie. L'approccio in questo manoscritto estende questi set di dati per esaminare le questioni relative all'emergenza e all'efficacia terapeutica. Per il picco SHC014, definiamo una minaccia dovuta alla replicazione nelle colture primarie delle vie aeree umane, il miglior modello disponibile per la malattia umana. Inoltre, la patogenesi nei topi indica una capacità di causare malattie nei modelli di mammiferi senza adattamento RBD. In particolare, il tropismo differenziale nel polmone e l'attenuazione di SHC014-CoV a lunghezza intera nelle colture HAE suggeriscono che fattori oltre il legame ACE2 possono contribuire all'emergenza tra cui la processività di picco, la biodisponibilità del recettore o l'antagonismo delle risposte immunitarie dell'ospite. Tuttavia, sono necessari ulteriori test su primati non umani per tradurre queste scoperte in potenziale patogeno nell'uomo. È importante sottolineare che, il fallimento delle terapie disponibili definisce una necessità fondamentale per ulteriori studi e sviluppo del trattamento. Con questa conoscenza, possono essere prodotti programmi di sorveglianza, reagenti diagnostici e trattamenti efficaci per proteggere dall'emergenza di CoV specifici del gruppo 2b come SHC014, nonché altri rami CoV che mantengono pool eterogenei simili.

Pur offrendo preparazione contro i futuri virus emergenti, questo approccio deve essere preso in considerazione nel contesto degli studi di GO of (Return of Function) (mandato del governo degli Stati Uniti). Sulla base di precedenti modelli di emergenza (Fig. 4a, b), la creazione di virus chimerici come SHC014-MA15 non avrebbe dovuto aumentare la patogenicità. Tuttavia, mentre SHC014-MA15 è attenuato rispetto al topo genitore adattato, studi equivalenti che esaminano il picco di Urbani di tipo selvaggio all'interno della spina dorsale MA15 non hanno prodotto perdita di peso e attenuazione della replicazione. In quanto tale, rispetto alla Urbani Spike-MA15 CoV, SHC014-MA15 costituisce un guadagno nella patogenesi (Fig. 1). Sulla base di questi risultati, i panel di revisione potrebbero ritenere che studi simili siano troppo rischiosi da perseguire poiché non è possibile escludere una maggiore patogenicità nei modelli di mammiferi. Insieme alle restrizioni sui ceppi adattati al topo e sugli anticorpi monoclonali generati contro i mutanti di fuga, la ricerca sull'emergenza di CoV e l'efficacia terapeutica possono essere fortemente limitate andando avanti. Insieme, questi dati e restrizioni rappresentano un crocevia di preoccupazioni per la ricerca del GOF; il potenziale per preparare e mitigare i futuri focolai deve essere valutato rispetto al rischio di creare agenti patogeni più pericolosi. Nello sviluppo di politiche che vanno avanti, è importante considerare il valore dei dati generati da questi studi e se giustificano ulteriori studi o i rischi inerenti.




Nel complesso, il nostro approccio ha utilizzato i dati della metagenomica per identificare una minaccia rappresentata dal CoV SHC014 di tipo pipistrello SARS circolante. Con la capacità di replicarsi nelle culture delle vie aeree umane, produrre patogenesi in vivo e sfuggire alle attuali terapie, i virus chimerici SHC014 illustrano la necessità sia di sorveglianza che di terapie migliorate contro i virus circolanti simili alla SARS. L'approccio sblocca anche i dati metagenomici per prevedere l'emergenza virale con possibili applicazioni per prepararsi a trattare le future infezioni da virus emergenti.

Saggi di virus, cellule, infezione in vitro e placca. SARS-CoV di tipo selvaggio (Urbani), SARS-CoV adattato per topo (MA15) e COV simili a SARS chimerici sono stati coltivati ​​su cellule Vero E6, coltivati ​​in DMEM (Gibco, CA) e siero di clone fetale al 5% (ciclone, Logan meridionale , UT) insieme a anti / anti (Gibco, Carlsbad, CA). Le cellule DBT che esprimono gli ortologi ACE2 sono state precedentemente descritte sia per l'uomo che per lo zibetto; sequenza ACE2 di pipistrello basata su Rhinolophus leschenaulti e stabilita come precedentemente descritto 22 . Gli esperimenti di pseudotipo erano basati sullo pseudovirus a base di HIV preparato come precedentemente descritto 23 ed esaminato su cellule HeLa che esprimevano ortesi ACE2 cresciuti nel terreno di Eagle modificato di Dulbecco integrato con siero di vitello fetale al 10% (Gibco) come precedentemente descritto 24. Le curve di crescita in Vero, DBT, Calu-3 2B4 e cellule epiteliali primarie delle vie aeree umane sono state eseguite come precedentemente descritto 22 , 25. Le cellule Vero E6 sono state originariamente ottenute da USAMRIID; Le cellule Calu3 sono state originariamente fornite dal Dr. CT Tseng, Università di Texas Medical Branch; nessuna delle scorte di lavoro della linea cellulare non è stata recentemente autenticata o testata per il micoplasma, sebbene le scorte di semi originali utilizzate per creare le scorte di lavoro siano prive di contaminazione. I polmoni umani per le colture di HAE sono stati acquistati in base ai protocolli approvati dall'Università del North Carolina presso il Chapel Hill Institutional Review Board e rappresentano epitelio delle vie aeree umane altamente differenziato contenente cellule epiteliali ciliate e non ciliate e cellule caliciformi. Le colture vengono anche coltivate su un'interfaccia aria-liquido per diverse settimane prima dell'uso come precedentemente descritto 26. In breve, le cellule sono state lavate con PBS e inoculate con virus o finte diluite in PBS per 40 minuti a 37 ° C. Dopo l'inoculazione, le cellule sono state lavate 3 volte e sono stati aggiunti nuovi mezzi per indicare il tempo 0. Tre o più replicati biologici sono stati raccolti in ciascun punto temporale descritto. Nessun accecamento è stato usato in nessuna raccolta di campioni né i campioni sono stati randomizzati. Tutta la coltivazione di virus è stata eseguita in un laboratorio BSL3 con ventilatori ridondanti in armadi di biosicurezza come descritto in precedenza dal nostro gruppo. Tutto il personale.....