Precedenti capitoli:
Statistiche di Primavera
Prosegue negli...:
Esperimenti (per un futuro migliore?!) (14)
Volendo ricorrere all'ironia, spesso arma di sopravvivenza
fondamentale nelle situazioni di panico generalizzato e antidoto alla paura di
provata efficacia, potremmo dire che la Cina ha appena vissuto il suo “momento
Fausto Tonna” (ex direttore finanziario durante il crac Parmalat).
Insomma, dalla denuncia di contabilità creativa nei criteri di
classificazione dei nuovi contagiati da coronavirus dovuta ai criteri
utilizzati per il computo all’implicita ammissione di sottostima degli stessi
sono passate solo 24 ore.
E questi due grafici mettono in prospettiva la magnitudo della
discrepanza occorsa in un così ridotto lasso di tempo e dopo l’annuncio di una
stabilizzazione dell’epidemia, prossima ormai al picco: in un solo giorno,
14.840 nuovi casi di contagio, capaci di portare il numero totale a 48.206.
Ma se questa palese ammissione di leggerezza nel trattamento delle
quarantene e nella diagnosi precoce di nuovi, potenziali contagiati apre
ulteriori, enormi interrogativi rispetto alla credibilità stessa del governo
cinese nella gestione dell’intera vicenda, ormai divenuta emergenza globale,
nella vicenda si inserisce questo documento, datato novembre 2015 e relativo a
una ricerca internazionale – descritta
in un articolo pubblicato su Nature Medicine:
L'emergere
della sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus (SARS-CoV) e sindrome
respiratoria del Medio Oriente (MERS) -CoV sottolinea la minaccia di eventi di
trasmissione tra specie che portano a focolai nell'uomo.
In
questo studio, esaminiamo il potenziale della malattia per i CoV simili
alla SARS che circolano attualmente nelle popolazioni di pipistrelli a ferro di
cavallo cinesi. Utilizzando il clone infettivo SARS-CoV, abbiamo generato e
caratterizzato un virus chimerico che esprime il picco del coronavirus di
pipistrello SHC014 in una spina dorsale SARS-CoV adattata al topo.
I
risultati indicano che i virus del gruppo 2b che codificano il picco SHC014 in
una spina dorsale di tipo selvaggio possono utilizzare in modo efficiente più
ortologi del recettore ACE2, replicarsi efficacemente nelle cellule primarie
delle vie aeree umane e ottenere titoli in vitro equivalenti ai ceppi epidemici
di SARS-CoV. Inoltre, esperimenti in vivo dimostrano la replicazione del virus
chimerico nel polmone del topo con notevole patogenesi.
La
valutazione delle modalità immunoterapiche e profilattiche basate sulla SARS ha
rivelato scarsa efficacia; entrambi gli approcci con anticorpi monoclonali e vaccini non
sono riusciti a neutralizzare e proteggere dai CoV utilizzando la nuova
proteina spike. È importante sottolineare che, sulla base di questi risultati,
abbiamo ridistribuito sinteticamente un virus ricombinante SHC014 a lunghezza
intera infettiva e dimostrato una solida replicazione virale sia in vitro che
in vivo. Insieme, il lavoro evidenzia un continuo rischio di riemergenza
SARS-CoV da virus attualmente circolanti nelle popolazioni di pipistrelli.
La
comparsa della sindrome respiratoria acuta grave Il coronavirus (SARS-CoV) ha
inaugurato una nuova era nella trasmissione tra le specie di gravi malattie
respiratorie. Da allora, numerosi ceppi, tra cui l'influenza A H5N1, H1N1, H7N9
e Sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS) CoV, sono emersi da
popolazioni di animali che hanno causato malattie e mortalità considerevoli.
Mentre le misure di salute pubblica hanno messo a tacere l'epidemia di SARS-CoV,
recenti studi di metagenomica hanno identificato sequenze di virus simili a
SARS strettamente correlati che circolano nelle popolazioni di pipistrelli
cinesi che potrebbero rappresentare una minaccia futura.
Tuttavia,
i soli dati di sequenza forniscono informazioni minime per identificare e
preparare futuri virus pre-pandemici. Pertanto, per esaminare il potenziale di emergenza dei CoV
circolanti, abbiamo creato un virus chimerico che codifica una nuova proteina
spike zoonotica nel contesto di una spina dorsale di CoV praticabile. Questo
approccio ha caratterizzato la minaccia rappresentata dal picco di SHC014-CoV
nelle cellule primarie delle vie aeree umane, in vivo, nonché l'inefficacia
delle terapie immunitarie disponibili. Insieme, la strategia traduce i dati
metagenomici per aiutare a prevedere e prepararsi per i futuri virus emergenti.
Le
sequenze SHC014 e WIV1 rappresentano i parenti più vicini ai ceppi epidemici
SARS-CoV (Fig. 1 a, b), ma mantengono importanti differenze nei 14 residui che
legano l'ACE2 umano, inclusi i cinque critici per l'intervallo ospite: Y442,
L472, N479, T487 e Y491 6 . Nel WIV1, tre di questi residui differiscono dalla
SARS-CoV Urbani, ma non ci si aspettava che alterassero il legame (Figura 1a, b
supplementare, Tabella 1 supplementare). Questo fatto è confermato da entrambi
gli esperimenti di pseudotipizzazione (Figura 1d supplementare) e dalla
replicazione in vitro di WIV1-CoV 5. Al contrario, sette dei 14 residui di
interazione ACE2 in SHC014 sono diversi da SARS-CoV, inclusi tutti e cinque i
residui critici (Supplementary Fig. 1c, Supplementary Table 1). Questi cambiamenti,
associati al fallimento dello pseudotipo (Fig. 1d supplementare), hanno
suggerito che il picco SHC014 non è in grado di legare l'ACE2 umano. Tuttavia,
cambiamenti simili erano stati segnalati per trasmettere il legame ACE2 nei
ceppi SARS-CoV correlati 6, 7 e quindi suggerito che per la verifica erano
necessari test funzionali. Pertanto, abbiamo sintetizzato il picco SHC014 nel
contesto del backbone SARS-CoV adattato al mouse competente per la replica
(SHC014-MA15) (Figura 2a supplementare). Nonostante le previsioni di entrambi i
modelli basati sulla struttura e gli esperimenti di pseudotipo, SHC014-MA15 era
praticabile e replicato a titoli elevati nelle cellule Vero (Figura 2b
supplementare). Simile alla SARS, SHC014-MA15 richiedeva anche una molecola
ACE2 funzionale per l'ingresso, ma utilizza ortologi umani, zibetto e
pipistrello (Figura 2c, d supplementare).
Per
testare la capacità del picco SHC014 di mediare l'infezione delle vie aeree
umane, abbiamo esaminato le cellule Calu-3 2B4, una linea cellulare epiteliale
umana, e abbiamo trovato una solida replica SHC014-MA15 paragonabile alla
SARS-CoV Urbani (Fig. 1c). Per estendere questi risultati, le colture
epiteliali delle vie aeree umane primarie (HAE) sono state infettate e hanno indicato
una replicazione robusta di entrambi i virus (Fig. 1d). Insieme, i dati
confermano la capacità del picco SHC014 di infettare le cellule delle vie aeree
umane e sottolineano la minaccia della trasmissione tra specie.
I
virus simili alla SARS si replicano nelle cellule delle vie aeree umane e
producono patogenesi in vivo (a) Le sequenze del genoma a lunghezza intera di
CoV rappresentative sono state allineate e mappate filogeneticamente come
descritto nei metodi. La barra di scala rappresenta sostituzioni nucleotidiche,
con solo il supporto bootstrap superiore al 70% etichettato. L'albero mostra i
CoV divisi in tre gruppi filogenetici distinti, definiti come α , β e γ . I
cluster di sottogruppi classici sono contrassegnati come 2a – 2d per i CoV β e
1a e 1b per i CoV α . ( b ) I domini S1 delle sequenze di aminoacidi di picco
di CoV β rappresentativi del gruppo 2b, incluso SARSCoV, erano allineati e
mappati filogeneticamente. La barra della scala rappresenta le sostituzioni di
aminoacidi. (c- d) Replicazione virale di SARS-CoV Urbani (nero) e SHC014-MA15
(verde) a seguito di infezione di (c) cellule Calu-3 2B4 o (d) colture
cellulari epiteliali delle vie aeree umane ben differenziate, aria-liquido
primarie un MOI di 0,01. I campioni sono stati raccolti in singoli punti
temporali con repliche biologiche ( n = 3) sia per gli esperimenti Calu3 che
per gli HAE. ( E - h ) in vivo infezione di 10 settimane di età BALB / topi c
infettati con 1 × 10 4 PFU di topo adattato SARS-CoV MA15 (nero) o SHC014-MA15
(verde) tramite l' in rotta che mostra ( e ) perdita di peso ( n = 9 per MA15
n= 16 per SHC014-MA15) e ( f ) replicazione virale nel polmone ( n = 3 per
MA15, n = 4 per SHC014-MA15) e antigene rappresentativo anti-SARS-CoV N che
tende per (g) SARS-CoV MA15 e (h) SHC014-MA15. Per ogni figura grafica, valore
centrale rappresentativo della media di gruppo e barre di errore definite da
SEM.
Successivamente
abbiamo valutato l'infezione in vivo di topi BALB / c di 10 settimane con 10 4
unità formanti placca (PFU) di SARS-MA15 o SHC014-MA15 (Fig. 1e-h). Gli animali
infetti da SARS-MA15 hanno subito una rapida perdita di peso e letalità per
quattro giorni dopo l'infezione (DPI); al contrario, SHC014-MA15 ha prodotto
una sostanziale perdita di peso (10%), ma nessuna letalità (Fig. 1e). L'esame
della replicazione virale ha rivelato titoli quasi equivalenti da polmoni di
topi infetti da SARS-MA15 e SHC014-MA15 (Fig. 1f). Mentre SARS-CoV MA15 ha
prodotto una colorazione robusta sia nei bronchioli terminali che nel
parenchima polmonare 2 DPI (Fig. 1g), SHC014-MA15 presentava un deficit nella
colorazione dell'antigene delle vie aeree (Fig. 1h).
Al
contrario, nessun deficit equivalente è stato osservato nel parenchima o nel
punteggio istologico complessivo, suggerendo un'infezione differenziale dopo
SHC014-MA15 (Tabella supplementare 2). Passando agli animali anziani più
sensibili, gli animali infetti SARS-MA15 hanno perso rapidamente peso e
soccombono alle infezioni (Figura 3 a, b supplementare); SHC014-MA15 indusse
una perdita di peso robusta e sostenuta, ma ebbe una mortalità minima.
L'istologia
e le tendenze di colorazione dell'antigene osservate nei topi giovani sono
state conservate negli animali più anziani (Tabella Supplementare 3). Abbiamo
escluso l'uso di un recettore alterativo basato sull'infezione da topi Ace2 - /
- , che non ha prodotto perdita di peso o colorazione dell'antigene a seguito
dell'infezione SHC014-MA15 ( Figura complementare 4a, b; Tabella supplementare
2 ). Insieme, i dati indicano che i virus che utilizzano il picco SHC014 sono
in grado di indurre una considerevole malattia nei topi nel contesto di una
spina dorsale virale CoV.
Data
l'efficacia delle terapie con anticorpi monoclonali di Ebola come ZMApp,
abbiamo successivamente cercato di determinare l'efficacia degli anticorpi
monoclonali SARS-CoV contro SHC014-MA15. Quattro ampiamente neutralizzando gli
anticorpi monoclonali umani erano stati precedentemente segnalati e sono
probabili reagenti per l'immunoterapia.
Esaminando
l'inibizione percentuale, SARS-CoV Urbani di tipo selvaggio è stato fortemente
neutralizzato da tutti e quattro gli anticorpi a concentrazioni di anticorpi
relativamente basse (Fig. 2a-d). Al contrario, la neutralizzazione variava per
SHC014-MA15. Fm6, un anticorpo generato dall'esposizione dei fagi e dai mutanti
di fuga 10, 11, ha raggiunto solo livelli di inibizione di SHC014-MA15 di fondo
(Fig. 2a). Allo stesso modo, anche gli anticorpi 230.15 e 227.14, derivati dalle cellule della memoria B dei pazienti con infezione da
SARS-CoV 12 , non sono riusciti a bloccare SHC014-MA15 ( Fig. 2b, c ). Per
tutti e tre gli anticorpi, le differenze tra i picchi SARS e SHC014
corrispondevano a cambiamenti di residui diretti o adiacenti rilevati nei
mutanti di fuga (fm6 - N479R; 230.15 - L443V; 227.14- K390). Infine,
l'anticorpo monoclonale 109,8 è stato in grado di ottenere una neutralizzazione
del 50% di SHC014-MA15, ma solo a concentrazioni molto elevate ( Fig. 2d ).
Insieme, i risultati dimostrano che, nonostante lo sviluppo di anticorpi
ampiamente neutralizzanti contro SARS-CoV, questi reagenti possono avere solo
un'efficacia marginale contro ceppi emergenti di CoV simili a SARS come SHC014.
Gli
anticorpi monoclonali SARS-CoV hanno un'efficacia marginale nei confronti di
CoV simili a SARS L'efficacia della neutralizzazione è stata valutata
utilizzando saggi di neutralizzazione percentuale contro SAR-CoV Urbani (nero)
o SHC014-MA15 con un pannello di anticorpi monoclonali: ( a ) fm6 ( n = 3 per
Urbani, n = 5 per SHC014-MA15) 10 , 11 , ( b ) 230.15 ( n = 3 per Urbani, n = 2
per SHC014-MA15), ( c ) 227.15 ( n = 3 per Urbani, n = 5 per SHC014-MA15) e ( d
) 109.8 ( n = 3 per Urbani , n = 2 per SHC014-MA15) 12, sono stati
originariamente generati contro l'epidemia di SARS-CoV. Ciascun punto dati
rappresentativo di più valori centrali rappresenta la media di gruppo e le
barre di errore definite da SEM.
Per
valutare i vaccini esistenti contro SHC014-MA15, i topi anziani sono stati
vaccinati con SARS-CoV intero intero (DIV) a doppia inattivazione. In
precedenza, il DIV aveva mostrato neutralizzazione e protezione dalla sfida del
virus omologa, ma l'insufficienza del vaccino e la patologia immunitaria
aumentata negli animali anziani indicavano una possibilità di danno a causa
della vaccinazione. In questo studio, DIV non ha fornito protezione da
SHC014-MA15 per quanto riguarda la perdita di peso o il titolo virale (Figura
5a, b supplementare). In linea con i precedenti rapporti 14, anche il siero di
topi anziani vaccinati con DIV non è riuscito a neutralizzare SHC014-MA15 (Figura
5c supplementare). Forse ancora più importante, la vaccinazione con DIV ha
prodotto una solida patologia immunitaria (Tabella supplementare 4) ed
eosinofilia ( Figura 5d – f supplementare ). Insieme, questi risultati
confermano l'insufficienza del vaccino DIV e la malattia aumentata illustrata
per il gruppo vaccinato invecchiato.
Contrariamente
a DIV, la sfida SHC014-MA15 come vaccino ha mostrato risultati promettenti, ma
con avvertimenti importanti. Utilizzando una dose elevata, abbiamo infettato i
topi giovani con SHC014-MA15 e seguito per 28 giorni; i topi sono stati
successivamente sfidati con SARS-MA15 (Figura 6a supplementare). Una precedente
infezione da alte dosi con SHC014-MA15 conferiva protezione contro la sfida
letale SARS-MA15, ma solo una minima risposta di neutralizzazione SARS-CoV
dagli antisieri SHC014-MA15 (Figura 6b supplementare, 1/200) implicava una
protezione ridotta nel tempo. Risultati simili sono stati osservati nei topi
BALB / C anziani in termini di perdita di peso e replicazione virale (Figura
6c, d supplementare). Tuttavia, questa dose di infezione ha indotto > 10% di
perdita di peso e letalità in alcuni animali anziani (Fig. 1 e Figura 3
supplementare). Usando l'infezione a basso dosaggio, SHC014-MA15 non è riuscito
a proteggere gli animali anziani dalla sfida letale SARS-CoV (Figura 6e, f
supplementare). Insieme, i dati suggeriscono che la sfida SHC014-MA15 può
conferire protezione incrociata contro SARS-CoV attraverso epitopi conservati,
ma richiede una dose che induca la patogenesi.
Avendo
stabilito il picco SHC014 come una potenziale minaccia, abbiamo successivamente
sintetizzato un clone infettivo SHC014-CoV a lunghezza intera basato
sull'approccio utilizzato per SARS-CoV ( Fig. 3a ) 15 . La replica nelle
cellule Vero non ha rivelato deficit per SHC014-CoV rispetto a SARS-CoV (Fig.
3b); tuttavia, SHC014-CoV è stato significativamente attenuato (p <0,01)
nelle colture epiteliali primarie delle vie aeree umane sia a 24 che a 48 ore
dopo l'infezione (Fig. 3c). L'infezione in vivo non ha dimostrato una
significativa perdita di peso, ma ha definito una replicazione virale ridotta
per l'infezione da SHC014-CoV a lunghezza intera rispetto alla SARS-CoV Urbani
(Fig. 3d, e). Insieme, i risultati stabiliscono la vitalità di SHC014-CoV a
tutta lunghezza, ma suggeriscono che è necessario un ulteriore adattamento
equivalente alla replicazione di SARS-CoV epidemica nelle cellule respiratorie
umane e nei topi.
SHC014-CoV
a tutta lunghezza si replica nelle vie aeree umane, ma manca di virulenza da
SARS epidemica ( a ) Il clone molecolare SHC014-CoV è stato sintetizzato come
sei cDNA contigui designati A - F affiancati da siti BglI unici che
consentivano l'assemblaggio diretto di cDNA a lunghezza intera. (b - c )
Replicazione virale di SARS-CoV Urbani (nero) e SHC014-CoV (verde) a seguito di
infezione di ( b ) cellule Vero o ( c ) colture cellulari epiteliali delle vie
aeree umane ben differenziate, aria liquida primaria e interfaccia di un MOI di
0.01. I campioni sono stati raccolti in un singolo momento con replicati
biologici (n = 3) per ciascun gruppo e rappresentativi di 1 esperimento sia per
Vero che per HAE. (d - e) In vivoinfezione di topi BALB / c di 10 settimane
infettati con 1 × 10 5 PFU di SARS-CoV Urbani (nero), SARS-CoV MA15 (grigio) o
SHC014-CoV (verde) tramite la via di arrivo che mostra ( d ) perdita di peso (
n = 3 per MA15, n = 7 per SHC014-CoV, n = 6 per SARS-Urbani) e ( e )
replicazione virale ( n = 3 per SARS-Urbani e SHC014-CoV) nel polmone. Ciascun
punto dati rappresentativo di più valori centrali rappresenta la media di
gruppo e le barre di errore definite da SEM. I valori P basati sul test T di
Student a 2 code di singoli punti temporali e sono contrassegnati come indicato:
** <0,01 *** <0,001.
Durante
l'epidemia di SARS-CoV, furono rapidamente stabiliti collegamenti tra zibetti
di palma e ceppi di coronavirus rilevati nell'uomo. Basandosi su questa
scoperta, il paradigma dell'emergenza comune ha sostenuto che l'epidemia di
SARS-CoV è nata come virus di pipistrello, è passata agli zibetti e ha
incorporato i cambiamenti all'interno del RBD per migliorare il legame con lo
zibetto Ace2 16. La successiva esposizione all'uomo nei mercati vivi ha
permesso l'infezione con il ceppo di zibetto, che, a sua volta, si è adattato
per diventare il ceppo epidemico (Fig. 4a). Tuttavia, l'analisi filogenetica ha
suggerito che i primi ceppi SARS umani sembrano più strettamente correlati al
pipistrello rispetto ai ceppi di zibetto 16. Pertanto, un secondo paradigma ha
sostenuto che la trasmissione diretta pipistrello-umano ha avviato l'emergenza
SARS-CoV, con zibetti di palma che fungono da ospite secondario e serbatoio per
l'infezione continua ( Fig. 4b , 17 ). Per entrambi i paradigmi, l'adattamento
del picco in un ospite secondario è visto come una necessità, con la maggior
parte delle mutazioni attese all'interno dell'RBD e facilitando il
miglioramento dell'infezione. Entrambe le teorie implicano che i pool di CoV di
pipistrelli sono limitati e che le mutazioni del raggio ospite sono sia casuali
che rare, riducendo la probabilità di eventi di emergenza futuri nell'uomo.
I
ceppi di coronavirus sono mantenuti in pool di quasi specie circolanti nelle
popolazioni di pipistrelli. (a - b) Le teorie sull'emergenza della SARS-CoV
tradizionale affermano che i mutanti della gamma degli ospiti (cerchio riempito
di rosso) rappresentano eventi casuali e rari che consentono l'infezione di
ospiti alternativi. (a) Il paradigma dell'ospite secondario sostiene che un
ospite non umano è infetto da un virus progenitore del pipistrello e,
attraverso l'adattamento, facilita la trasmissione all'uomo; la successiva
replicazione nell'uomo porta al virus dell'epidemia. (b) Il paradigma diretto
suggerisce che la trasmissione avviene tra pipistrelli e umani senza che sia
richiesto un ospite intermedio; la selezione si verifica quindi nella
popolazione umana con virus strettamente correlati che si replicano in un
ospite secondario, consentendo la persistenza e l'adattamento virali continui
in entrambi. (c) I dati provenienti da virus chimerici simili alla SARS sostengono
che i pool di quasi specie mantengono più virus in grado di infettare le
cellule umane senza la necessità di mutazioni (cerchi riempiti di rosso).
Mentre adattamenti in ospiti secondari o umani possono essere richiesti per
l'emergenza epidemica, se combinati con backbone virulenti di CoV (contorni
verdi), la malattia epidemica può essere il risultato nell'uomo. I dati
esistenti supportano elementi di tutti e tre i paradigmi.
Pur
non invalidando le altre vie di emergenza, il presente studio sostiene un terzo
paradigma in cui i pool di CoV di pipistrelli circolanti mantengono proteine di picchi "in bilico" in grado di infettare
l'uomo senza mutazione o adattamento (Fig. 4c). Illustrato con picco SHC014
nella spina dorsale SARS-CoV, si verifica un'infezione robusta in entrambe le
culture delle vie aeree umane e in vivo senza adattamento RBD. Associato alla
precedente identificazione di backbone CoV patogeni, i risultati suggeriscono
che i materiali di partenza richiesti per i ceppi emergenti simili alla SARS
circolano attualmente in serbatoi di animali. È importante sottolineare che,
sebbene SHC014-CoV a tutta lunghezza richieda probabilmente un ulteriore
adattamento della spina dorsale per mediare la malattia umana, gli eventi di
ricombinazione ad alta frequenza documentati nelle famiglie di CoV sottolineano
la possibilità di emergenze future e la necessità di ulteriore preparazione.
Ad
oggi, gli schermi di genomica delle popolazioni animali sono stati utilizzati
principalmente per identificare nuovi virus nelle impostazioni delle epidemie.
L'approccio in questo manoscritto estende questi set di dati per esaminare le
questioni relative all'emergenza e all'efficacia terapeutica. Per il picco
SHC014, definiamo una minaccia dovuta alla replicazione nelle colture primarie
delle vie aeree umane, il miglior modello disponibile per la malattia umana.
Inoltre, la patogenesi nei topi indica una capacità di causare malattie nei
modelli di mammiferi senza adattamento RBD. In particolare, il tropismo differenziale
nel polmone e l'attenuazione di SHC014-CoV a lunghezza intera nelle colture HAE
suggeriscono che fattori oltre il legame ACE2 possono contribuire all'emergenza
tra cui la processività di picco, la biodisponibilità del recettore o
l'antagonismo delle risposte immunitarie dell'ospite. Tuttavia, sono necessari
ulteriori test su primati non umani per tradurre queste scoperte in potenziale
patogeno nell'uomo. È importante sottolineare che, il fallimento delle terapie
disponibili definisce una necessità fondamentale per ulteriori studi e sviluppo
del trattamento. Con questa conoscenza, possono essere prodotti programmi di
sorveglianza, reagenti diagnostici e trattamenti efficaci per proteggere
dall'emergenza di CoV specifici del gruppo 2b come SHC014, nonché altri rami
CoV che mantengono pool eterogenei simili.
Pur
offrendo preparazione contro i futuri virus emergenti, questo approccio deve
essere preso in considerazione nel contesto degli studi di GO of (Return of
Function) (mandato del governo degli Stati Uniti). Sulla base di precedenti
modelli di emergenza (Fig. 4a, b), la creazione di virus chimerici come
SHC014-MA15 non avrebbe dovuto aumentare la patogenicità. Tuttavia, mentre
SHC014-MA15 è attenuato rispetto al topo genitore adattato, studi equivalenti
che esaminano il picco di Urbani di tipo selvaggio all'interno della spina
dorsale MA15 non hanno prodotto perdita di peso e attenuazione della
replicazione. In quanto tale, rispetto alla Urbani Spike-MA15 CoV, SHC014-MA15
costituisce un guadagno nella patogenesi (Fig. 1). Sulla base di questi risultati,
i panel di revisione potrebbero ritenere che studi simili siano troppo
rischiosi da perseguire poiché non è possibile escludere una maggiore
patogenicità nei modelli di mammiferi. Insieme alle restrizioni sui ceppi
adattati al topo e sugli anticorpi monoclonali generati contro i mutanti di
fuga, la ricerca sull'emergenza di CoV e l'efficacia terapeutica possono essere
fortemente limitate andando avanti. Insieme, questi dati e restrizioni
rappresentano un crocevia di preoccupazioni per la ricerca del GOF; il
potenziale per preparare e mitigare i futuri focolai deve essere valutato
rispetto al rischio di creare agenti patogeni più pericolosi. Nello sviluppo di
politiche che vanno avanti, è importante considerare il valore dei dati
generati da questi studi e se giustificano ulteriori studi o i rischi inerenti.
Nel
complesso, il nostro approccio ha utilizzato i dati della metagenomica per
identificare una minaccia rappresentata dal CoV SHC014 di tipo pipistrello SARS
circolante. Con la capacità di replicarsi nelle culture delle vie aeree umane,
produrre patogenesi in vivo e sfuggire alle attuali terapie, i virus chimerici
SHC014 illustrano la necessità sia di sorveglianza che di terapie migliorate
contro i virus circolanti simili alla SARS. L'approccio sblocca anche i dati
metagenomici per prevedere l'emergenza virale con possibili applicazioni per
prepararsi a trattare le future infezioni da virus emergenti.
Saggi di virus, cellule, infezione in vitro e placca.
SARS-CoV di tipo selvaggio (Urbani), SARS-CoV adattato per topo (MA15) e COV
simili a SARS chimerici sono stati coltivati su cellule Vero E6,
coltivati in
DMEM (Gibco, CA) e siero di clone fetale al 5% (ciclone, Logan meridionale ,
UT) insieme a anti / anti (Gibco, Carlsbad, CA). Le cellule DBT che esprimono
gli ortologi ACE2 sono state precedentemente descritte sia per l'uomo che per
lo zibetto; sequenza ACE2 di pipistrello basata su Rhinolophus leschenaulti e
stabilita come precedentemente descritto 22 . Gli esperimenti di pseudotipo
erano basati sullo pseudovirus a base di HIV preparato come precedentemente
descritto 23 ed esaminato su cellule HeLa che esprimevano ortesi ACE2 cresciuti
nel terreno di Eagle modificato di Dulbecco integrato con siero di vitello
fetale al 10% (Gibco) come precedentemente descritto 24. Le curve di crescita
in Vero, DBT, Calu-3 2B4 e cellule epiteliali primarie delle vie aeree umane
sono state eseguite come precedentemente descritto 22 , 25. Le cellule Vero E6
sono state originariamente ottenute da USAMRIID; Le cellule Calu3 sono state
originariamente fornite dal Dr. CT Tseng, Università di Texas Medical Branch;
nessuna delle scorte di lavoro della linea cellulare non è stata recentemente
autenticata o testata per il micoplasma, sebbene le scorte di semi originali
utilizzate per creare le scorte di lavoro siano prive di contaminazione. I
polmoni umani per le colture di HAE sono stati acquistati in base ai protocolli
approvati dall'Università del North Carolina presso il Chapel Hill Institutional
Review Board e rappresentano epitelio delle vie aeree umane altamente
differenziato contenente cellule epiteliali ciliate e non ciliate e cellule
caliciformi. Le colture vengono anche coltivate su un'interfaccia aria-liquido
per diverse settimane prima dell'uso come precedentemente descritto 26. In
breve, le cellule sono state lavate con PBS e inoculate con virus o finte
diluite in PBS per 40 minuti a 37 ° C. Dopo l'inoculazione, le cellule sono
state lavate 3 volte e sono stati aggiunti nuovi mezzi per indicare il tempo 0.
Tre o più replicati biologici sono stati raccolti in ciascun punto temporale
descritto. Nessun accecamento è stato usato in nessuna raccolta di campioni né
i campioni sono stati randomizzati. Tutta la coltivazione di virus è stata eseguita
in un laboratorio BSL3 con ventilatori ridondanti in armadi di biosicurezza
come descritto in precedenza dal nostro gruppo. Tutto il personale.....
Nessun commento:
Posta un commento